Известные способы определения концентрации общего белка в сыворотке (плазме) крови можно разделить на:
– азотометрические: классический метод Кьельдаля (1883) и его модификации;
– основанные на определении плотности сыворотки (плазмы);
– гравиметрические (весовые);
– нефелометрические;
– спектрофотометрические, заключающиеся в измерении степени светопоглощения в ультрафиолетовой области (200-220 или 280 нм);
– колориметрические, основывающиеся на цветных реакциях белков с определенными реактивами либо на неспецифическом связывании красителя;
– флюориметрические;
– поляриметрические;
– другие, к которым относят аминокислотный анализ, метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии и др.
Азотометрические методы
Ввиду того, что белки являются соединениями, в состав которых обязательно входит азот, для количественного определения белка в биологическом материале использовали определение содержания азота. В методе Кьельдаля, в настоящее время представляющем в целом исторический интерес, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до NH4+ , и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, NH4+ может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения NH4+ в N2 под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы.
При использовании азотометрических (с колориметрическим и другим завершением) способов принято исходить из того, что среднее содержание азота в «общем» белке составляет 16%. Поэтому полученная при определении белкового азота величина умножается на 6,25 (100:16). Однако следует иметь в виду, что в плазме крови, кроме белкового, всегда обнаруживается небелковый (остаточный) азот. К тому же фактор пересчета 6,25 является усредненным: процент содержания азота в различных индивидуальных молекулах белка колеблется от 14 до 19, что вызывает отклонение этого коэффициента в пределах от 5,3 до 8,1.
Метод Кьельдаля до сих пор используют в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости. Его недостатком является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в качестве метода сравнения.
Методы, основанные на определении плотности сыворотки крови (способом падающей капли), неточны, так как плотность зависит от содержания не только белков, но и других веществ, находящихся в плазме.
Рефрактометрический способ основан на способности растворов белка к преломлению светового потока. При температуре 17,5 °С показатель преломления воды равен 1,3332, при той же температуре показатель преломления сыворотки колеблется в пределах 1,3480–1,3505. В связи с тем, что концентрация электролитов и небелковых органических соединений, влияющих на ее преломляющую способность, невелика и достаточно постоянна в сыворотке, величина показателя преломления сыворотки крови зависит в первую очередь от содержания в ней белков. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания белка в сыворотке крови.
Однако, на показатель преломления влияют небелковые компоненты сыворотки крови, например минеральные вещества, пигменты, углеводы, липиды, фракции остаточного азота. При некоторых патологических состояниях их содержание увеличивается, что приводит к значительным ошибкам в определении. Это касается исследования желтушных и хилезных сывороток, а также сывороток больных сахарным диабетом и страдающих уремией.
Гравиметрические методы базируются на предварительном осаждении белков, их обезвоживании высушиванием и взвешивании на весах для очень точного взвешивания (аналитические и др.). Эти методы трудоемки, поскольку необходимо отделить белок от небелковых веществ и идеально его обезводить; кроме того, для выполнения анализа требуется сравнительно большой (около 1 мл и более) объем биологической жидкости (несколько мг белка).
Колориметрические методы
Достаточно просты, почти все из них не могут быть применены к исследованию одного-единственного, конкретного белка, к тому же он может отличаться по своей природе от белка-стандарта (эталона).
Из колориметрических способов особого внимания заслуживают методы, основанные на биуретовой реакции, впервые описанной в 1914 г. Сущность метода состоит в том, что в щелочной среде ионы меди образуют с белками комплексы фиолетового цвета. При отщеплении атома водорода от энольной группы пептидной связи появляется отрицательный заряд, обеспечивающий связывание атома кислорода с ионом меди (в формировании комплекса имеет значение и связь иона меди с атомами азота за счет свободных электронных пар). При этом различие в интенсивности окрашивания комплексов, образованных альбумином и глобулинами, незначительно.
Биуретовую реакцию дают не только белки, но и пептиды, состоящие из 3 и более аминокислот. Для выполнения реакции содержащий белок раствор подщелачивают добавлением сегнетовой соли, после чего в него вносят избыток сульфата меди. Через некоторое время измеряют интенсивность окрашивания, зависящую от содержания белка. Концентрацию белка устанавливают обычно по интенсивности светопоглощения при длине волны 540-580 нм. Предел чувствительности биуретового метода, т. е. предел обнаружения белка в пробе, ограничивается концентрацией 300 мг/л, что в большинстве случаев делает невозможным его использование для определения концентрации белка в нативной моче.
В дальнейшем последовал ряд модификаций этого метода, направленных на увеличение стабильности биуретового реактива (с помощью этиленгликоля, солей винной, лимонной кислот и других реагентов), улучшение режима фотометрии и других условий.
В 1962 г. Элмианн предложил при определении содержания белка биуретовым методом использовать ультрафиолетовое излучение с длиной волны 263 нм, что привело к 10-15-кратному возрастанию чувствительности метода по сравнению с таковой способа, основанного на измерении светопоглощения в видимой области спектра. Итцхэки и Гилл (1964) рекомендовали замерять оптическую плотность анализируемых образцов при длине волны 310 нм, поскольку, как выяснилось, в присутствии значительных количеств ДНК регистрация абсорбции при 263 нм может дать существенную ошибку.
Так как на биуретовую реакцию не влияет присутствие в крови ароматических аминокислот (тирозина, триптофана), фенолов, мочевой кислоты, этот метод по нраву считается самым специфичным, точным и практически доступным.
Для количественного определения низких концентраций белка широко используют метод Лоури (1951). В данном методе сочетаются две реакции. Первая – биуретовая реакция. Во второй реакции (собственно реакция Фолина) задействован реактив Фолина-Чокальтеу. В ней образуются окрашенные в синий цвет комплексы фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислоты под действием тирозина и триптофана, входящих в состав белков.
Метод Лоури оказался примерно в 100 раз чувствительнее биуретового в его обычном исполнении и в 10-20 раз – метода, основанного на измерении поглощения белком ультрафиолетового света с длиной волны 263 и 280 нм. Метод Лоури в силу его большей чувствительности по сравнению с биуретовым методом обычно используют для определения низких концентраций белка (в пределах 10–60 мг/л). Его применяют в научных исследованиях и практически не используют в клинических лабораториях.
Существенным недостатком его является сравнительно невысокая специфичность. Многие присутствующие в анализируемых образцах вещества мешают определению белка с реактивом Фолина. К ним относятся мочевая кислота, гуанин, ксантин, фенолы (за исключением нитрофенола), аминокислоты глицин, тирозин, гистидин, цистин; гидразин, сульфат аммония. Реакция развивается и с аденином, аденозином, цитозином, цитидином, урацилом, тимидином. Определение белка методом Лоури затрудняют тиоловые соединения, углеводы, глицерин, детергенты, хелатные реактивы, дисульфидные реагенты, ионы калия, ацетилацетон, салицилаты, антибиотики,, гистамин и другие физиологически активные амины. Присутствие в белковых препаратах продуктов перекисного окисления липидов также может дать значительную ошибку. Некоторые из веществ, используемых для приготовления буферных растворов, способны, влиять на определение белка по Лоури. Так, широко распространённый трис-буфер, помимо образования неспецифического окрашенного соединения, подавляет взаимодействие реактива Лоури с белками. Эгилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), применяющаяся обычно в качестве антикоагулянта, мешает определению белка по Лоури уже при концентрации 0,5 ммоль/л. На результатах определения сказывается влияние детергентов, используемых для солюбилизации белков.
Таким образом, при использовании метода Лоури большое число различных соединений может исказить картину действительного содержания общего белка и его фракций. Другой недостаток метода Лоури заключается в том, что в нем используют два реактива, и оба имеют небольшой срок годности.
В последние годы предложены простые колориметрические методы, основывающиеся на неспецифическом связывании ряда красителей с белками. Некоторые из них дают воспроизводимые (при соблюдении определенных условий) результаты и обладают достаточно высокой чувствительностью. Характерным для методов этой группы является то, что степень связывания красителя (за счет обычной адсорбции) зависит от индивидуальных свойств присутствующих в плазме отдельных белков. Следует к тому же иметь в виду, что зависимость степени абсорбции от концентрации белка не линейна. Для количественного определения белка используются такие красители, как амидо черный, бромкрезоловый зеленый, тимоловый синий, метиловый фиолетовыйSB, конгорот, ализа-ринсульфат натрия, ксиленовый яркий цианиновый, нафталиновый сине-черный и др.
Большое внимание специалистов клинической лабораторной диагностики привлекает находящий все более широкое применение предложенный Брэдфордом (Bradford, 1976) чувствительный, простой и удобный в исполнении способ определения белка в биологических жидкостях с помощью красителя Кумасси бриллиантового синего (КБС) G-250. Важной особенностью, этого красителя является способность связываться с пептидами, содержащими не менее I5 аминокислот, благодаря чему он не дает окрашенного комплекса со свободными аминокислотами и низкомолекулярными олигопептидами. Этот краситель в нейтральной среде имеет синюю окраску, в кислой – оранжевую, с максимумом поглощения при длине волны 465 нм. Комплекс «белок-краситель» также имеет синий цвет. В слабокислых растворах КБС G-250 приобретает два отрицательных заряда и легко связывается с основными аминокислотами – лизином, аргинином, гистидином. Предполагается, что молекула красителя образует своеобразный мостик между положительно заряженными молекулами белка, реагируя с ними двумя отрицательно заряженными группами индикатора, в результате чего формируется относительно крупный комплекс «белок-краситель».
Нефелометрические методы. Основаны на снижении растворимости белков и образования суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрический метод анализа), определяемого числом светорассеивающих частиц, либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).
Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих специфических белков с использованием специфичных антител.
Спектрофотометрические методы
В последние годы несравненно большее внимание стало уделяться определению общего белка в биологических жидкостях способом ультрафиолетовой фотометрии. Свойство поглощать световой поток с длиной волны 280 нм обусловлено присутствием в белках аминокислот тирозина, триптофана и, в меньшей степени, фенилаланина. Нуклеиновые кислоты также обладают абсорбцией при 280 нм, иногда в 10 раз превышающей таковую белка, что нередко искажает величину истинного его содержания. Поскольку поглощение раствором белка монохроматического ультрафиолетового светового потока зависит и от величины рН, такие, часто именуемые спектрофотометрическими, измерения обычно проводят в условиях щелочной среды. Основной недостаток метода, базирующегося на измерении светопоглощения при длине волны 280 нм, заключается в больших различиях содержания ароматических аминокислот в составе отдельных белков анализируемой пробы. К тому же даже небольшая мутность раствора может явиться источником серьезных ошибок. Исходя из того, что белок и нуклеиновые кислоты имеют разные коэффициенты абсорбции, Варбург и Христиан разработали способы, позволяющие определять в исследуемом образце содержание и белка, и нуклеиновых кислот (по значениям оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм) либо устанавливать содержание белка в присутствии нуклеиновых кислот.
Большинство белков имеет максимум поглощения при длине волны 280 нм, что обусловливается содержанием в них остатков триптофана и тирозина. Нуклеиновые кислоты, содержащиеся во многих белках, также частично поглощают свет с длиной волны 280 нм, хотя максимум абсорбции ультрафиолетового светового потока приходится на 260 нм. Варбург и Христиан экспериментально определили коэффициент абсорбции различных белков и нуклеиновых кислот при длине волны 280 и 260 нм, а также соотношение этих величин (1989). Калькар предложил специальную формулу для определения концентрации белка в биологических жидкостях:
С(г/л)= 1,45 • А280-0,74 • А26о.
Используя данный методический подход, становится возможным получить точные результаты при условии, если содержание нуклеиновых кислот не превышает 20% от уровня белка. Приведенная формула оказалась весьма удобной для определения содержания индивидуальных нуклеопротеинов. Условием выполнения методики является применение спектрофотометра (ультрафиолетового фотометра) и кювет с шириной слоя раствора 1 см.
В последние годы широко используется «прямой» метод определения белка в более далекой ультрафиолетовой области, а именно при длине волны 220 нм. В этой области примеси нуклеиновых кислот в пределах до 0,5 мг/л не мешают определению белка, а коэффициент абсорбции протеинов при длине волны 220 нм оказывается значительно более высоким по сравнению с таковым при длине волны 280 нм, что в целом повышает специфичность метода. Определение содержания белка в более далекой ультрафиолетовой области — при 200 нм — представляет собой еще более специфичный и чувствительный метод исследования, поскольку белки при длине волны 200 нм обладают абсорбцией, в 20 раз превышающей таковую при 280 нм. Примечательно, что абсорбция при 200 нм обусловлена наличием в белках пептидных связей. Для прямого же определения концентрации белка используют область около 186 нм, на которую приходится пик поглощения пептидной связью. Однако большинство известных спектрофотометров (ультрафиолетовых фотометров) не позволяют проводить замеры в этой области, поэтому для определения содержания белка в биологических объектах вынужденно приходится использовать более длинноволновую часть ультрафиолетового спектра.
Очень перспективным представляется высокочувствительный флюориметрический метод анализа, основанный на включении в структуру белка или полипептида флюорогенной (т.е. способной к флюоресценции) метки. Так, использование флюоресцамина открыло возможность определения белка методом люминесцентного анализа, причем в очень низких концентрациях. Флюоресцамин, реагируя с первичными аминогруппами белка, образует комплекс, способный к испусканию света флюоресценции (475 нм) при ее возбуждении световым потоком с длиной волны 390 ни. Если применение методов абсорбционной фотометрии в ультрафиолетовой и видимой (способ Лоури) областях спектра позволяет определять содержание белка в концентрация до 10 мг/л, то чувствительность метода с применением флюоресцентной метки — на порядок выше (т. е. до 1 мг/л).
Предложен также полярографический микрометод определения белка, отличающийся весьма высокой чувствительностью и простотой (практически не требует проведения дополнительных процедур).
Весьма чувствительный метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии позволяет определять белок в окрашенных или опалесцирующих растворах.
Из приведенного обзора методов определения общего белка следует, что в каждом конкретном случае в зависимости от цели исследования и с учетом ожидаемого содержания белка в анализируемой жидкости может быть выбран тот или иной метод анализа.
В качестве основного для использования в клинической лабораторной диагностике выбранколориметрический биуретовый метод определения общего белка в сыворотке (плазме) крови.