Специальные методы исследования крови

К специальным методам исследования крови прибегают в тех случаях, когда необходимо и возможно установить диагноз на уров­не изучения морфологических характеристик клеток в мазке или из­менения их функциональных свойств под воздействием различных фак­торов. В первом случае исследования ведут с использованием цито­химических красителей, специфически реагирующих с определенными включениями или компонентами клеток; функциональные свойства клетки определяют как ответ на физико-химические воздействия.

    Эритроциты. Для выявления характера анемии прибега­ют к исследованиям клеток на резистентность и специальным цитохи­мическим исследованиям.

    Резистентность (или устойчивость) эритроцитов значительно снижается при некоторых гемолитических анемиях, обус­ловленных дефектом эритроцитов. Наиболее распространено в клинике исследование осмотической резистентности эритроци­тов, основанное на определении максимальной и минимальной степени гемолиза эритроцитов при инкубации их в растворе с различной кон­центрацией хлорида натрия. При снижении резистентности эритроцитов появление гемолиза наступает при более высокой концентрации соли (0,6-0,7% раствор и даже 0,8%). Резкое снижение устойчивости мембран эритроцитов наблюдается при микросфероцитозе, а повышенное – в случае талассемии.

      Исследование механической резистентности осно­вано на определении в плазме гемоглобина после обработки крови в аппарате для встряхивания. В норме после этого воздействия в плазме обнаруживают 15-30 г/л гемоглобина, снижение механической устойчивости сопровождается образованием большого количества ге­моглобина и характерно для ряда приобретенных форм гемолитичес­ких анемий.

    Кислотная резистентность определяется на основании различной кислотоустойчивости эритроцитов, определяемой по време­ни наступления гемолиза. При графическом выражении кривая кисло­тоустойчивости имеет треугольную форму, начало гемолиза отмечается на 3-й минуте, максимум приходится на 4-5-ю минуту, а полный гемолиз наблюдается через 8-10 минут. Гемолитические анемии и связанные с ними гиперретикулоцитоз, наследственный микросфероцитоз сопровождаются повышенной кислотоустойчивостью эритроцитов, при некоторых формах несфероцитарных гемолитических анемий кислотоустойчивость нормальная.

     Цитохимические исследования эритроцитов проводят в мазках крови с использованием специфической химической реакции для определения различных ве­ществ. Относительная простота, быстрота выполнения и доступное оборудование дают преимущество этим полуколичественным методам, значительно уступающим биохимическим методам определения.

     Внутриклеточное железо определяют с помощью специфической реакции на берлинскую лазурь, позволяющей обнаружить в эритроцитах гранулы железа (сидероциты). Уменьшение числа сидероцитов наблюдается при железодефицитных анемиях, уве­личение – при гемолитических анемиях, особенно в период криза.

      Внутриэритроцитарные включения выявляют путем денатурации гемоглобина под влиянием окисляющих ве­ществ (бриллиантовый крезиловый синий и др.) с образованием в клет­ках мелких круглых гранул синего цвета. Появление их в эритроцитах свидетельствует о неустойчивости гемоглобина к окислению.

     Тельца Гейнца определяют с помощью неокисляющих красителей (метиловый фиолетовый и др.). В эритроцитах выяв­ляются одиночные круглые крупные гранулы фиолетового или синего цвета. Появление их в эритроцитах, как и внутриэритроцитарных включений, свидетельствует о наличии патологически нестабильных форм гемоглобина, дефиците ферментов и других формах гемолитичес­кой анемии.

     Фетальный гемоглобин эритроцитов опре­деляют цитохимически на основании его большой кислотоустойчивости по сравнению с гемоглобином взрослых животных. У здоровых новорож­денных в крови преобладают эритроциты, содержащие фетальный ге­моглобин (окрашенные эритроциты после кислотного воздействия). У взрослых животных такие окрашенные эритроциты в мазках встречают­ся в единичных случаях. Увеличение эритроцитов с фетальным гемог­лобином отмечают при β–талассемии, различных анемиях, заболе­ваниях легких, сердечно-сосудистой системы, гемобластозах, неко­торых острых инфекциях.

      Активность фермента глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г-6-ФД)  в эритроцитах определяют по нали­чию гранул формазана – продукта реакции нитросинего тетразолия и НАДФ H₂. При нормальной активности Г-6-ФД в эритроцитах образу­ется 10-20 гранул формазана. Уменьшение их числа является призна­ком ферментодефицитной (Г-6-ФД) гемолитической анемии.

    Лейкоциты. Цитохимическое исследование используется для выявления функциональных изменений свойств клеток, изучения процессов внутриклеточного метаболизма и особенностей распределе­ния различных веществ в клетках.

     Щелочная фосфатаза – гидролитический фер­мент, относящихся к фосфомоноэстеразам. Щелочная фосфатаза в ви­де окрашенных комплексов обнаруживается в цитоплазме нейтрофилов, в основном в специфической зернистости.

    Повышение активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах наблю­дается при воспалительных процессах, в послеоперационный период, при ожогах, циррозе печени, опухолях, гемобластозах, полицитемии. Снижение активности фермента характерно для вирусных инфек­ций, некоторых форм малокровия, миелолейкоза.

       Кислая фосфатаза – гидролитический фермент, локализующийся в основном в лизосомах цитоплазмы клетки. Наиболее изучена активность фермента в нейтрофилах и лимфоцитах. Активность фермента выявляется в виде гранул синего или чер­ного цвета. В норме активность кислой фосфатазы обнаруживают в 15-20% нейтрофилов и лимфоцитов. Повышение процента выявления этого фермента в нейтрофилах отмечает при воспалительных процессах, инфекциях, пневмониях, аллергических заболеваниях, туберкулезе, опухо­лях. В лимфоцитах активность фермента повышается после иммуниза­ции и при заболеваниях лимфопролиферативной природы.

        Пероксидаза – окислительный фермент, обнаруживае­мый в цитоплазме 100% гранулоцитов, начиная со стадии промиелоцита. Особенно высокая активность пероксидазы наблюдается в цито­плазме эозинофилов. В клетках лимфоидного ряда фермент отсутству­ет. Снижение активности пероксидазы нейтрофилов отмечено при ту­беркулезе, ревматизме, инфаркте миокарда, опухолях, в том числе и при гемобластозах. При острых лейкозах исследование на пероксидазу является дифференциальным для острого миелобластного и лимфобластного лейкозов.

       Неспецифические эстеразы  – группа ферментов, гидролизирующих эфиры карболовых кислот и локализую­щихся в цитоплазме моноцитов, нейтрофилов, лимфоцитов. Активность этих ферментов изменяется при некоторых формах лейкозов (промиелоцитарный, миелобластный и др.)

       Дегидрогеназы – окислительно-восстановительные ферменты, локализующиеся в основном в митохондриях клеток. В норме наибольшая активность ферментов обнаружена в лимфоцитах, ее снижение характерно для опухолевых и аллергических заболеваний. При хроническом лимфолейкозе наблюдается снижение дегидрогеназ в лимфоцитах.

        Гликоген – полисахарид, выявляемый в цитоплазме нейт­рофилов, лимфоцитов, моноцитов. В лимфоцитах содержание гликоге­на невелико и обнаружено в норме у примерно 10% клеток. Увеличение числа гликогенположительных нейтрофилов отмече­но при воспалительных процессах, полицитемии; увеличение числа гликогенположительных лимфоцитов (до 50-80%) характерно для хрони­ческого лимфолейкоза.

       Липиды содержатся в цитоплазме гранулоцитов в специфи­ческой зернистости. Увеличение содержания липидов в нейтрофилах наблюдается при острых и хронических лейкозах.

    Тромбоциты. К специальным исследованиям тромбоцитов прибегают для выявления нарушения их функции. Наиболее распростра­нены определения агрегации, адгезии и реакции освобождения.