МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ЗАБЕЗПЕЧЕНОСТІ ТВАРИН ВОДОРОЗЧИННИМИ ВІТАМІНАМИ
Для діагностики гіповітамінозів проводять дослідження вмісту вітамінів в біологічних об’єктах. Для визначення вітамінів використовують колориметричні, спектрофотометричні, флюорометричні, методи високоефективної рідинної (ВЕРХ) і тонкошарової (ТШХ) хроматографії. Для визначення окремих вітамінів застосовують тест-культури мікроорганізмів, швидкість росту яких залежить від концентрації окремого вітаміну. Останнім часом високочутливими методами є радіоімунні та хемілюмінісцетні методи. Для визначення окремих вітамінів розроблено комерційні тест-системи, що ґрунтуються на ІФА.
Тіамін надходить в організм тварин із кормами і синтезується в жуйних мікрофлорою передшлунків, у тварин з однокамерним шлунком – у товстому кишечнику. За рахунок цього синтезу свині задовольняють потребу в тіаміні на 50 %.
Засвоєння тіаміну залежить також від можливої присутності в кормах антагоністів вітаміну В1, які виявлені в деяких видів прісноводної риби, молюсків, мікроорганізмах і грибах. У рослинах знайдені антивітаміни фенольної природи. Антагоністами тіаміну є також похідні геміну, оризотоксин шліфованого рису, деякі ненасичені жирні кислоти.
Біологічно активною формою тіаміну є тіаміндифосфат (кокарбоксилаза), який синтезується в печінці. Кокарбоксилаза є коферментом карбоксилаз, у складі яких вона виконує кілька важливих реакцій – декарбоксилювання і карбоксилювання, зокрема кетокислот, а також є коферментом транскетолази, яка відіграє важливу роль у вуглеводному обміні. За нестачі тіаміну активність транскетолази знижується, що викликає дефіцит пентоз і відновлених форм нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату (НАДФН2).
У складі піруватдекарбоксилази тіаміндифосфат бере участь в окиснювальному декарбоксилюванні піровиноградної кислоти, перетворюючи її в ацетилКоА, який надходить у ЦТК. Тіаміндифосфат є коферментом дегідрогенази альфа-кетоглутарової кислоти і дегідрогенази гамма-оксиальфа-кетоглутарової кислоти, а тому за його дефіциту блокується перебіг реакцій ЦТК.
За нестачі тіаміну в клітинах головного мозку порушується вуглеводний обмін, У клітинах нагромаджуються піровиноградна, молочна та гліоксалова кислоти, які мають токсичний вплив на мозкову тканину; розвивається некроз нейронів.
Біохімічними критеріями діагностики недостатності тіаміну є зменшення вмісту тіаміну в крові хворих тварин. У хворих тварин зменшується не лише вміст загального тіаміну, а й відносна частка його активної форми. Одночасно з цим у сироватці крові підвищується вміст піровиноградної і молочної кислот. Уміст тіаміну можна визначати також у печінці.
Дослідження проводять методами флуориметрії, колориметрії і мікробіологічними, використовуючи найбільш чутливий до нестачі цього вітаміну мікроорганізм Lactobacillus fermentum-36. Найчастіше застосовують флуориметричний метод, що ґрунтується на його екстракції ізобутиловим або ізоаміловим спиртом, окисленні червоною кров’яною сіллю в тіохром з подальшим вимірюванням флюоресценції.
Рибофлавін синтезується в передшлунках жуйних, а в моногастричних тварин – мікрофлорою товстого кишечнику. Кролі свою потребу в рибофлавіні задовольняють копрофагією.
Після всмоктування у кишечнику частина вітаміну В2 фосфорилується з утворенням рибофлавін-5-фосфат або рибофлавінмононуклеотид (ФМН). У крові вони зв’язуються зі специфічним білком і таким чином транспортуються в печінку, де відбувається синтез флавінаденіндинуклеотиду (ФАД) і частково ФМН. Обидві сполуки є коферментами понад 60 флавінових ферментів (флавопротеїнів).
Рибофлавінові ферменти присутні практично у всіх тканинах і беруть активну участь у тканинному диханні.
Недостатність вітаміну В2 частіше реєструють у птиці, хутрових звірів, свиней, рідше – у жуйних. У телят В2-гіповітаміноз розвивається в ранній період життя, коли ще не почав функціонувати рубець. У хутрових звірів причиною В2-гіповітамінозу є нестача в раціоні м’яса, печінки, дріжджів, молока. Ендогенна недостатність рибофлавіну розвивається при хронічних розладах травлення, пригніченні життєдіяльності мікрофлори рубця і товстого кишечнику антимікробними та іншими засобами.
Діагноз В2-вітамінної недостатності ґрунтується на визначенні вітаміну в різних субстратах: крові, печінці та яйцях. Під лабораторних досліджень найчастіше застосовують здатність рибофлавіну до флюоресценції після його відділення від білків.
Пантотенова кислота, або вітамін В3 – це біологічно малоактивна речовина. Найбільш важливою похідною сполукою її є коензим А (КоА), якому належить провідна роль у у вуглеводному та жировому обміні, у звільненні енергії в циклі Кребса.
У жуйних потреба у вітаміні В3 задовольняється синтезом його мікрофлорою передшлунків, у моногастричних тварин – товстих кишок. Особливо інтенсивно синтезується пантотенова кислота в кишечнику кролів. У сільськогосподарських тварин (крім птиці), які утримуються на звичайних раціонах, дефіцит пантотенової кислоти не проявляється.
Дефіцит пантотенової кислоти в хутрових звірів може виникати при годівлі сухими і вареними кормами, які містять окиснені жири, а також за нестачі в раціоні дріжджів і печінки.
Симптоми В3-гіповітамінозу частіше виявляють у курчат, індичат і каченят. Проявляється хвороба дерматитами, насамперед на кінцівках, пізніше – навколо дзьоба і очей, та паралічами. У хутрових звірів нестача вітаміну В3 характеризується затриманням росту і посивінням волосся.
Лабораторна діагностика порушень обміну вітаміну В3 грунтується на визначенні його кількості в крові, печінці, молоці та яйцях. Найчастіше використовується мікробіологічний метод з використанням Lactobacillus plantatum або деяких штамів Saccharomyces cerevisiae.
Нікотинова кислота (нікотинамід, ніацин, вітамін В5, РР) всмоктується в тонкому кишечнику, надходить у печінку, де перетворюється в активну форму – нікотинамід. Сполучаючись із нуклеотидами, нікотинамід утворює два коферменти – нікотинамідаденіндинуклеотид
(НАД) і нікотинамідаденін-динуклеотидфосфат
(НАДФ). Обидва коферменти беруть участь більш як у 150 реакціях розщеплення вуглеводів, жирів, окисненні спиртів, амінокислот. НАД і НАДФ є першою ланкою в ланцюзі тканинних дихальних ферментів.
Достатня кількість вітаміну В5 у дорослих жуйних синтезується мікроорганізмами в передшлунках, у телят – ендогенно із амінокислоти триптофану, тому вони потребують екзогенної нікотинової кислоти лише в ранньому віці. У свиней вітамін В5 синтезується ендогенно у тканинах із триптофану і мікроорганізмами в товстому кишечнику, проте з товстих кишок він майже не всмоктується. У собак, котів і хутрових звірів (норок, лисиць і песців) хвороба виникає при утриманні на раціонах, до складу яких не вводять сире м’ясо, печінку, молочні продукти, оскільки синтез нікотинової кислоти із триптофану в них досить обмежений. Синдром нестачі ніацину проявляється в собак у вигляді “чорного язика”.
Контролюють обмін нікотинової кислоти за її вмістом у печінці, молоці, крові, яйцях. Застосовують фотометричний та мікробіологічний (з використанням культури Lactobacillus arabinosus) методи дослідження.
Вітамін В6
(піридоксин) існує у формі піридоксину, піридоксалю і піридоксаміну. У тканинах тварин вітамін В6 знаходиться переважно у формі піридоксальфосфату і піридоксальамінофосфату. Вони входять як простетична група до складу більше 20 ферментів – трансаміназ, декарбоксилаз, дезаміназ та інших, під впливом яких у тканинах і клітинах відбуваються безперервні процеси синтезу і розпаду амінокислот.
В організмі сільськогосподарських тварин вітамін В6 може синтезуватись ендогенно: у жуйних – мікрофлорою передшлунків та товстих кишок, у коней, свиней, менше у птиці – мікрофлорою кишечнику. Дорослі кролі забезпечують потребу у вітаміні В6 за рахунок мікробіального синтезу в кишечнику і копрофагією. Проте у деяких кормах – льняній макусі, насінні окремих бобових – є антагоністи піридоксину.
Піридоксин добре всмоктується в кишечнику, окиснюється в піридоксаль з наступним його фосфорилуванням. Із сечею переважно виділяється 4-піридоксалова кислота, а за нестачі вітаміну В6
різко збільшується виділення ксантуренової кислоти, визначення якої є важливим для діагностики патології.
При нестачі піридоксину продукти порушеного обміну речовин негативно впливають на всі органи і тканини, спричинюючи дистрофічні і атрофічні процеси в шкірі, нервових клітинах та паренхіматозних органах. У головному мозку внаслідок зниження активності декарбоксилази, яка каталізує утворення g-аміномасляної кислоти, нагромаджується глутамінова кислота, внаслідок чого підвищується збудливість кори і розвиваються епілептичні судоми. Нестача піридоксину спричинює зниження вмісту гемоглобіну в крові, у крові виявляють мікроцитоз, олігохромемію і гіпохромію, рідше – олігоцитемію.
Діагностують недостатність піридоксину за лікувальним ефектом і результатами визначення ксантуренової кислоти в сечі та вмістом піридоксину в крові і молоці.
Фолієва кислота, або вітамін Вс, в організмі відновлюється в активну форму – тетрагідрофолієву (ТГФК), яка в якості простетичної групи входить до складу багатьох ферментів – птеропротеїнів. Вони забезпечують зворотне перетворення серину в гліцин, гомоцистеїну – у метіонін, а також беруть участь у гемопоезі, біосинтезі пуринового і піримідинового ядра нуклеїнових кислот. ТГФК стимулює гемопоез, посилюючи синтез гемоглобіну і дозрівання еритроцитів у кістковому мозку.
Потреба тварин у фолієвій кислоті в молочний період забезпечується за рахунок вітаміну молозива і молока. У подальшому велике значення має ендогенний синтез її в рубці та кишечнику і екзогенне надходження вітаміну. Сульфаніламідні препарати конкурують з фолієвою кислотою, а тому за тривалого застосування можуть зумовлювати характерні ознаки гіповітамінозу.
За нестачі фолієвої кислоти розвивається макроцитарна гіпохромна анемія, у звірів погіршується якість хутра. Молодняк птиці погано вкривається пір’ям, перо в індиченят і дорослої птиці депігментується, спостерігаються паралічі жуйних м’язів, слабкість кінцівок і ознаки перозу. У собак і кішок дефіцит фолієвої кислоти малоймовірний.
Біохімічна діагностика порушень обміну фолієвої кислоти грунтується на визначенні її вмісту у плазмі кров і в печінці. Методики визначення фолієвої кислоти складні: запропоновані спеціальні методи по Herbert (1966) і Cooperman (1968) поєднують мікробіологічні методи з хроматографічної технікою поділу фолатів.
Ціанокобаламін (вітаміну В12) у природі синтезується мікроорганізми. Дорослі жуйні повністю забезпечують себе ціанокобаламіном за рахунок мікробного синтезу, свині, птиця, собаки і хутрові звірі потребують додаткового надходження вітаміну з кормом.
У біологічних реакціях бере участь не вільний кобаламін, а так звані В12-коферменти (кобамідні ферменти) – метилкобаламін і дезоксіаденозилкобаламін. За їх участю синтезуються метіонін, холін, креатинін, нуклеїнові кислоти, сульфогідрильні групи. Завдяки стимуляції утворення метіоніну і холіну вітамін В12 має ліпотропну дію і поліпшує білоксинтезувальну функцію печінки.
Вітамін В12
стимулює перетворення пропіонової кислоти, що утворюється в рубці жуйних, у глюкозу. Ціанокобаламін стимулює еритроцитопоез, впливаючи на перетворення фолієвої кислоти в тетрагідрофолієву, яка прискорює дозрівання еритроцитів.
Недостатність ціанокобаламіну характеризується анемією видимих слизових оболонок, поступовим зниженням апетиту, спотворенням смаку, зниженням вгодованості і продуктивності. Контроль за станом обміну ціанокобаламіну проводиться за вмістом його в молозиві, молоці, крові, печінці та у жовтках яєць.
Для безпосереднього визначення вмісту ціанкобаламіну використовують хроматографічні (ВЕРХ, ТШХ), мікробіологічні (з E. Coli шт. ATCC 9637 і 113-3, а також ІФА та радіоізотопного аналізу. Важливе значення має визначення в сечі вмісту метилмалонової кислоти, рівень якої за дефіциту вітаміну зростає.
Біотин (вітамін Н) В організмі тварин, з’єднуючись з апоферментом, утворює різні ферментні системи, які беруть участь у реакціях карбоксилювання і транскарбоксилювання. При дефіциті біотину гальмується включення ацетату в жирні кислоти печінки, амінокислоти і тканинні білки, знижується синтез дикарбонових кислот, а внаслідок цього – й білка.
Недостатність біотину в хутрових звірів виникає при тривалому згодовуванні їм кормів, що містять продукти окиснення жирів, які руйнують біотин, та рибних відходів, а також при використанні протягом тривалого часу антибактеріальних препаратів, котрі пригнічують синтез вітаміну мікрофлорою, та при згодовуванні біотинзв’язувального білка – авідину, що міститься в яйцях курей, качок, гусей та індиків.
За дефіциту біотину розвивається дерматит, який супроводжується виділенням жиру залозами шкіри, тобто розвивається себорея.
Біохімічні методи контролю недостатності біотину включають визначення його вмісту в яйцях, молоці та печінці. Для визначення застосовують мікробіологічні (з культурами Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, Ochromonas danica, Micrococcus sodonensis, Neurospora crassa, Rhizobium trifolii, Escherichia coli C162) та хроматографічні (ВЕРХ).
Аскорбінова кислота бере участь в окиснювально-відновних процесах (під час окиснення вона перетворюється в дегідроаскорбінову кислоту) та в утворенні колагену. Включення проліну і лізину в білки і наступне їх гідроксилювання відбувається за участі аскорбінової кислоти, яка стимулює перетворення проліну в оксипролін, дозрівання фібробластів та синтез колагену і таким чином забезпечує цілісність стінок судин. За нестачі вітаміну С затримується перетворення проліну в оксипролін, синтез глікопротеїнгліканів, унаслідок чого порушується колоїдний стан міжклітинної речовини, що призводить до підвищення проникності і крихкості кровоносних судин, крововиливів у шкіру, видимі слизові оболонки, тканини і органи.
Вітамін С бере участь у гемопоезі. Він стимулює всмоктування заліза в кишечнику, включення його в молекулу гему, активує редуктазу, яка сприяє перетворенню фолієвої кислоти в тетрагідрофолієву. За його участі відбувається синтез гемоглобіну.
Діагностують С-вітамінну недостатність за вмістом вітаміну в сироватці крові, печінці, молоці та молозиві. Використовуються колориметричні (що ґрунтуються на перетворенні тривалентного заліза в двовалентне і визначенні останнього з 2,2′-дипіридилом), титрометричні (на реакції з 2,6-дихлорінофенолятом натрію). Однак, ці реакції придатні лише для визначення відновленої форми аскорбінової кислоти, але не придатні для дегідроаскорбінової кислоти. Тому в крові визначають обидві форми вітаміну за реакцією з 2,4 динітрофенілгідразином, який утворює з обома формами аскорбінової кислоти в присутності сірчаної кислоти сполуку червоного кольору. В останній час використовується ВЕРХ.
Вітамін В4 (холін). З жиру і холіну в печінці утворюються холінфосфатиди (лецитини), які забезпечують постійний відплив жирових речовин із печінки у кров’яне русло і попереджують розвиток жирової дистрофії гепатоцитів. Таким чином холін проявляє ліпотропну дію. Важливу роль відіграє холін у синтезі ацетилхоліну, який є медіатором нервового збудження.
У молекулі холіну містяться “лабільні” метильні групи, необхідні для багатьох реакцій тканинного синтезу, проте вони починають використовуватися лише за недостатньої кількості метіоніну в кормах. Нестача метіоніну спричинює більш інтенсивне використання холіну. У той же час для синтезу холіну у тварин джерелом метильних груп може бути лише метіонін.
Нестача холіну в поєднанні з дефіцитом марганцю в раціонах птиці призводить до розвитку захворювання, яке одержало назву пероз.
Біохімічний контроль обміну холіну передбачає визначення його концентрації в крові, молоці та молозиві, печінці та жовтках яєць. Для цього широко використовують метод H.M. Eidin et
al. (1969), який ґрунтується на утворенні екстрагованої хлороформом сполуки холіну з бромтимоловим синім. Крім того, застосовується хемілюмінесцентний аналіз, ВЕРХ.