ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ЛАКТАТДЕГІДРОГЕНАЗИ, КЛІНІЧНЕ ЗНАЧЕННЯ
Лактатдегідрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27) – гліколітичний (цитозольний цинквмісний) фермент, що зворотньо каталізує окиснення L-лактату до піровиноградної кислоти в присутності окисленого нікотинаденіндинуклеотиду.
Фермент широко поширений в організмі. По мірі зменшення активності ензиму органи і тканини можуть бути розташовані в такому порядку: нирки, серце, скелетні м’язи, підшлункова залоза, селезінка, печінка, легені, сироватка крові.
ЛДГ в цитоплазмі клітин та сироватці крові представлена 5 ізоферментами. Ця кількість зумовлена наявністю 2 олігомерів – субодиниці М (muscle) та субодиниці Н (heart), що утворюють 5 ізоформ, які позначаються у відповідності до їх рухливості в електричному полі як: ЛДГ1(НННН), ЛДГ2 (НННМ), ЛДГ3 (ННММ), ЛДГ4 (НМММ) та ЛДГ5 (ММММ).
Субодиниця М виявляється переважно у тканинах з анаеробним метаболізмом, тоді як субодиниця Н присутня в тканинах із переважанням аеробних процесів. Ізофермент ЛДГ1 здійснює окиснення лактату до пірувату в тканинах з аеробним типом метаболізму (міокард, мозок, нирки, еритроцити, тромбоцити), а ЛДГ5, навпаки, пірувату до лактату в тканинах з високим рівнем гліколізу (скелетні м’язи, печінка). На відміну від ЛДГ5 ізофермент ЛДГ1 володіє стійкістю до дії сечовини.
Інші ізоферменти на додаток до пяти «нормальних» виявляються у сироватці крові тварин зі злоякісними новоутвореннями та за гострих захворювань печінки.
ЛДГ міститься не тільки в плазмі, але й у значній кількості в еритроцитах, тому сироватка не повинна мати слідів гемолізу.
Методи визначення загальної активності ЛДГ поділяються на дві основні групи: 1) кінетичні, що базуються на оптичному тесті Варбурга та 2) методи кінцевої тонки.
У 1956 р. Уокер зі співав. запропонував використовувати реакцію окиснення лактату до пірувату. За перебігом реакції можна слідкувати за приростом абсорбції при 340 нм, що відображає активність ферменту (кінетичний метод).
Серед колориметричних методів кінцевої точки найвідомішими є способи, основані на утворенні піруват-2,4-динітрофенілгідразону, що дає коричневе забарвлення у лужному середовищі. Більш обмежено використовуються редоксіндикаторні методи, що ґрунтуються на визначенні НАД•Н за допомогою тетразолійформазанової реакції або реакції з 2,6-дихлорфеноліндофенолом.
Серед колориметричних методів кінцевої точки найбільш точним є метод Севела і Товарека, оснований на тому, що L-лактат у лужному середовищі в присутності ЛДГ сироватки та доданого НАД окиснюється до пірувату. Використовуючи цей метод, можна досліджувати і сечовиностабільну фракцію ЛДГ, щоґрунтується на здатності сечовини майже на 100% інгібувати активність ЛДГ5. При паралельному визначенні активності загальної ЛДГ розраховують відсоток вмісту стабільної до сечовини фракції.
Для вивчення ізоферментного спектрі ЛДГ використовують способи, що ґрунтуються на: фракціонуванні методом зонального електрофорезу або хроматографії з подальшим тетразольним забарвленням;
– диференційованому неселективному та селективному інгібуванні ізоензимів ЛДГ: піруватом (ЛДГ1 більш чутлива до його впливу, ніж ЛДГ5), лактатом, оксалатом (більше інгібує ЛДГ1, ніж ЛДГ5), сечовиною (інактивуєЛДГ5);
– різниці у тепловій стабільності ізоферментів (ЛДГ1 стабільний при 65°С, інші ізоферменти за такої температури швидко інактивуються);
– застосуванні антитіл (до ЛДГ1 та ЛДГ5): імунохімічні тести.
Методи хімічного інгібування (наприклад, сечовиною або лактатом) дають невірогідні результати. Теплова інактивація, за якої блокується ЛДГ5, також знаходить обмежене застосування, оскільки у всіх інших ізоферментів є певна теплова нестабільність і для отримання відтворних результатів необхідно точне дотримання температурних умов. Методи имуноінгібування дають можливість визначити лише ЛДГ1.
Підвищення активності лактатдегідрогенази. Активність ЛДГ в сироватці крові зростає при анеміях, злоякісних новоутвореннях, гепатиті, обтураційній жовтяниці, цирозі печінки, різних захворюваннях нирок, опорно-рухового апарату, інфаркті міокарду, ураженнях легень, а також при будь-яких ушкодженнях клітин, що призводить до цитолізу та втрати цитоплазми (цей фермент легко переходить у плазму крові при некробіотичних процесах у клітинах).
При гострому гепатиті активність ЛДГ в сироватці крові підвищена в перші тижні жовтушного періоду, відсоток сечовиностабільної фракції ЛДГ знижується. Характерно, что ступінь підвищення не залежить від тяжкості захворювання. Після клінічного одужання може спостерігатися підвищення відносної активності ЛДГ4 та ЛДГ5, що свідчить про незакінчений відновний процес у печінці. Активність ЛДГ в сироватці крові підвищена в перші тижні жовтушного періоду, відсоток сечовиностабільної фракції ЛДГ знижується. Характерно, что ступінь підвищення не залежить від тяжкості захворювання. Після клінічного одужання може спостерігатися підвищення відносної активності ЛДГ та ЛДГ, що свідчить про незакінчений відновний процес у печінці.
Активність ензиму значно зростає при хірургічній патології, що супроводжується шоковим станом, вираженою гіпоксією, декомпенсацією серцево-судинної діяльності.
При інфаркті міокарду активність ферменту в сироватці крові зростає через 8-10 год, досягаючи максимуму через 24-28 год і залишаючись підвищеною протягом першого тижня захворювання. Підвищення активності ЛДГ відбувається в основному за рахунок збільшення вмісту ЛДГ1 та ЛДГ2. Інфаркт міокарду супроводжується зростанням активності сечовиностабільної фракції ЛДГ, що вказує на наявність гострого інфаркту задовго до його підтвердження ЕКГ та у передінфарктному стані.
Слід зазначити, що збільшення загальної активності ЛДГ або відношення ЛДГ1/ЛДГ2 спостерігається також внаслідок гемолізу любого походження (in vivo та in vitro), анемії, гострих захворюваннях нирок. У хворих тварин зі злоякісними новоутвореннями домінуючою ізоформою ензиму є ЛДГ3.
При жовчокам’яній хворобі без обтурації жовчних ходів підвищення активності ЛДГ не відзначається, тоді як при обтураційній жовтяниці різко зростає. Це може спостерігатися і при перитоніті, коли в патологічний процес втягується печінка.
До зростання загальної активності ЛДГ призводить застосування кофеїну, введення анаболічних стероїдів, тестостерону, знеболюючих препаратів, дикумарину, сульфаніламідів, кодеїну.
Зменшення активності ЛДГ викликають оксалати, що використовуються в якості антикоагулянтів, та сечовина.
ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ КРЕАТИНКІНАЗИ В СИРОВАТЦІ КРОВІ
Креатинкіназа (КК), яку називають також креатинфосфокіназою (КФК) (АТФ:креатин-фосфотрансфераза; КФ 2.7.3.2) являє собою ензим, що зворотно каталізує фосфорилювання креатину за допомогою АТФ:
.
Креатинкіназа відіграє важливу роль в енергетичному обміні м’язової, нервової та інших тканин. Найбільше ферменту містять скелетна мускулатура, міокард та мозок. Достатньо високою активність КК є в щитоподібній залозі та легенях.
КК – гетерогенний ензим, молекула якого складається з двох субодиниць – В та М, що мають майже однакову молекулярну масу. Оскільки молекула ферменту має димерну структуру, при комбінації цих субодиниць утворюється три ізоферменти: ММ – мязовий, ВВ – мозковий та MB – гібридний, що міститься у великій кількості в серцевому м’язі. В міокарді міститься два ізоферменти – MB та ММ, причому активність ізоферменту MB складає близько 25% загальної активності. Певні органи і тканини мають характерний для них набір ізоферментів. Зміни їх вмісту в окремих органах відображається на спектральній картині ізоензимів КК сироватки (плазми) крові.
Для визначення активності КК застосовують дві основні групи методів: за кінцевою точкою та кінетичні.
Методи дослідження загальної активності КК сироватки крові за кінцевою точкою ґрунтуються або на визначенні креатину, або на підставі обліку утвореного (за кількістю неорганічного фосфату, що накопичується) креатинфосфату. До числа перших перш за все відносять методи, які базуються на оцінці лабільності (нестійкості) в кислому середовищі утвореного за впливу КК креатинфосфату (у порівнянні з ним АДФ і АТФ кислотостійкі). У способі визначення креатинкіназної активності за Єннору і Стоккеном (1953) кількість використаного під час реакції креатину визначається за його кольоровою реакцією з альфа-нафтолом і диацетилом.
Методи ж, що ґрунтуються на визначенні концентрації креатинфосфату (за утвореним неорганічним фосфатом) є більш складними, багатоетапними. На результатах аналізу відображається погана якість обробки (миття) лабораторного посуду.
Кінетичні методи базуються на використанні як прямої, так і зворотної реакції, однак перевага віддається другій – с використанням креатинфосфату і АДФ в якості субстрату. Більшість кінетичних методів базується на оптичному тесті Варбурга з використанням спряжених ферментативних реакцій.
Для дослідження ізоферментного спектру КК застосовують методи зонального електрофорезу та імунологічні тести.
Активність креатинкінази переважно визначають в сироватці крові. Сироватку рекомендується зберігається при 4ºС без доступу світла, оскільки фермент незворотно інгібується за дії денного (синього) світла, особливо якщо сироватки заморожені. Використання плазми, що містить гепарин, ЕДТА або цитрат, може призвести до прискорення реакції. Гемолізовану сироватку і плазму крові не можна використовувати для визначення. Фізичні навантаження можуть підвищувати каталітичну концентрацію КК в плазмі крові.
Оскільки ізоферменти КК знаходяться в скелетній мускулатурі, міокарде та ЦНС, визначення загальної активності КК застосовують в основному для діагностики міопатій, інфаркту міокарду, захворювань ЦНС.
Даний тест отримав найбільш широке застосування для діагностики інфаркту міокарду. При значних вогнищах інфаркту міокарду чутливість тесту відповідає 98%. Активність ферменту, що в 15-20 разів перевищує норму, приходить до вихідної величини на 5-8-у добу від початку захворювання.
Найбільш ефективний тест для діагностики інфаркту міокарду — дослідження МВ-ізоферменту. Його максимальна активність відзначається через 20 год після перших клінічних симптомів інфаркту міокарду, зниження до нормального рівню зазвичай відбувається через 40-50 год від початку захворювання.
Високу активність КК (в 6-10 разів вищу від норми) спостерігають при м’язовій дистрофії. При прогресуючій м’язовій дистрофії (міопатії) зростання показника (10-50-разове) спостерігається уже на перших стадіях хвороби, ще до появи чітких клінічних ознак патологічного стану. Високою є активність КК і при інших м’язових захворюваннях – міокардиті, запальних і дистрофічних ураженнях скелетної мускулатури, правці, генералізованих судомах, пароксизмальній тахікардії, внутрішньом’язових ін’єкціях лікарських засобів (особливо наркотичних препаратів і анальгетиків), гіпертермії.
Підвищене значення активності ферменту виявляють і у здорових тварин після значного фізичного навантаження, спортивних змагань, проведення хірургічних втручань.
Підвищена активність КК спостерігається при гіпотиреозі (внаслідок генералізованого підвищення мембранної проникності), знижена – при тиреотоксикозі.
Зростання активності КК відбувається і при захворюваннях ЦНС. У тварин із цереброваскулярними порушеннями та епілепсією виявляється висока активність ферменту в сироватці крові, однак мозковий ізофермент не виявляється. При багатьох інших захворюваннях мозку, оперативних втручаннях на ньому, трепанації черепа активність КК зростає. Аналогічний ефект дає гемоліз, що зумовлюється виділенням у сироватку крові аденілатциклази.
Значне зменшення активності ферменту спостерігається при дії на пробу сироватки (плазми) крові прямих сонячних або ультрафіолетових променів.